基于时间分辨免疫层析的快速、灵敏的降钙素原 (PCT) 侧流免疫分析方法
邵向阳, 1, † 王从荣, 2, † 谢春梅, 1 王先国, 3 梁荣良, 1和徐伟文1, *
Nicole Jaffrezic-Renault，学术编辑
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抽象的
降钙素原 (PCT) 是当前常用的严重细菌感染标记物。本研究的目的是开发一种经济高效的检测试剂盒，用于快速定量和现场检测 PCT。为了开发新型PCT定量检测试剂盒，采用基于时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）结合侧流免疫分析（LFIA）的双抗体夹心免疫荧光分析。从线性、精密度、准确度和特异性方面评估了新开发的试剂盒的性能。纳入234份血清样本进行对比试验。新型PCT定量检测试剂盒表现出更高的灵敏度（0.08 ng/mL）。批间变异系数（CV）和批内变异系数分别为 5.4%–7.7% 和 5.7%–13.4%。回收率在 93% 至 105% 之间。此外，与 Roche Elecsys BRAHMS 的 PCT 试剂盒相比，获得了高度相关性（n = 234，r = 0.977，p < 0.0001）和一致性（Kappa = 0.875）。至此，成功建立了新的PCT定量检测方法。结果表明，基于 TRFIA 与 LFIA 相结合的新开发系统适合 PCT 的快速现场检测，这可能是床旁检测中其他生物标志物的有用平台。
关键词：时间分辨，免疫层析，降钙素原（PCT）
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一、简介
降钙素原 (PCT) 是前肽降钙素的非激素前体，由 114 至 116 个氨基酸组成 [ 1 ]。最近的研究表明，细菌感染时血清PCT水平显着升高，这已被广泛应用于感染的诊断[ 2 , 3 ]。PCT 血清生理水平低于 0.5 ng/mL，但升高至高于 2 ng/mL 则表明存在脓毒症 [ 4 ]。PCT 的可检测水平在细菌感染中升高，但在大多数其他炎症反应中不会升高，例如病毒感染 [ 5 ]、自身免疫性疾病和创伤，这使得 PCT 成为具有高特异性和敏感性的脓毒症的极好标志物 [ 6 ]。快速准确的PCT 检测和监测对于抗生素治疗决策非常重要，特别是在重症监护病房( ICU )中[ 7,8,9,10,11,12,13 ] 。
近年来，多种PCT免疫分析方法已应用于临床，如基于化学发光免疫分析（CLIA）的PCT检测试剂盒[ 14 ]、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）、酶联荧光分析（ELISA）和免疫层析等。测试（ICT）。虽然CLIA和TRFIA都能准确定量血清PCT，且灵敏度高、准确度高，但检测设备规模较大，限制了其在设备落后的场所或急诊病房和ICU中的使用。相反，ELISA和ICT可以在现场快速、方便地使用，但其准确性受到其敏感性和非定量性的限制。因此，迫切需要开发一种准确、快速、定量、操作简便的PCT特异性标志物检测试剂盒。
基于荧光标记的侧流试纸条定量检测是一种新兴方法，已广泛应用于临床诊断[ 15,16,17 ]。与传统的荧光标记，如Cy-3和Cy-5 ，甚至量子点相比，最近报道的用于侧流免疫分析（LFIA）的镧系元素螯合物作为荧光标记具有一些独特的特征[ 18,19,20,21 ] ]。发射光谱窄、激发光谱宽（613 nm、333 nm）和大斯托克斯位移的特点，由于其自身独特的发射信号，可以轻松区分，从而消除了与使用许多现有荧光团相关的背景荧光。铕 (Eu) (III) 螯合纳米颗粒的半衰期较长，非常适合用于时间分辨荧光 (TRF) 读取系统，该系统可在一定时间间隔后识别特定的结果信号。这些特性带来了更宽的检测范围、更高的灵敏度和准确性等极具吸引力的性能。此外，可以使用不同的镧系元素螯合物进行多重标记，以便在一次测试中同时检测生物标志物。与 LFIA 和便携式 TRF 读取系统相结合，提高了定量即时检测 (POCT) 的检测性能，例如快速性和准确性。这种新的组合系统被认为是定量 POCT 中非常有潜力的系统 [ 22 ]。但目前尚无基于其的PCT报告或产品。本研究将羧酸盐修饰的铕(III)(Eu(III))螯合物微粒(CM-EUs)应用于LFIA试纸上，用于快速定量和现场检测血清样品中的PCT。
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2。材料和方法
2.1. 材料与试剂
PCT单克隆抗体(MJG03)和抗原(JG01)获自杭州Kitgen生物技术有限公司(中国浙江杭州)。PCT 单克隆抗体 (16B5) 购自 HyTest Ltd.（Joukahaisenkatu，图尔库，芬兰）。单克隆抗体MJG03与Eu(III)偶联并固定在偶联垫上，而16B5作为捕获抗体固定在硝酸纤维素(NC)膜的测试线上。牛血清白蛋白 (BSA) 和 Elecsys BRAHMS PCT 试剂盒购自 Roche Diagnostics（美国印第安纳州印第安纳波利斯）。NC 膜、结合垫和吸收垫均购自 Millipore（美国马萨诸塞州贝德福德）。山羊抗兔 IgG 购自 Fitzgerald Industries International, Inc.（美国马萨诸塞州北阿克顿）。兔 IgG (RI-gG) 购自 Merck and Co., Inc.（美国新泽西州凯尼尔沃思）。CM-EU 购自 Thermo Fisher Scientific Inc.（参考号 93470520010150，Waltham，MA，USA）。样品垫购自杰一生物技术公司（中国上海）。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (磺基-NHS)、4-吗啉乙磺酸 (MES)、聚乙烯醇 (PVA)、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、Trition-X100、钠酪蛋白酸盐、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷和离心过滤装置（带有 Ultracel-50 膜）购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Milli-Q 水纯化系统（Millipore，Bedford，MA，美国）用于制备超纯水（pH 6.5–8.5，总有机碳 1–5 ppb）。
2.2. 缓冲溶液
缓冲溶液如下：结合垫处理缓冲液(50mM Na 2 HPO 4 ·12H 2 O、0.5％PVA、1％TritonX-100和0.5％BSA，pH 7.4)；封闭缓冲液（0.025 M 磷酸盐缓冲液，2% BSA，pH 7.4）；结合缓冲液（25 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0）；样品垫处理缓冲液（0.1 M Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O、1% PVP、0.2% Casein-Na、1% TritonX-100、1% Tetronic 1307 和 0.2% NaN 3）；洗涤缓冲液（0.025 M Tris-HCl、0.9% NaCl、0.2% Tween-20 和 0.05% Proclin-300，pH 7.8）；激活缓冲液（25 mM MES，pH 6.1）；样品稀释缓冲液（0.9% NaCl、0.1% Proclin-300、0.2% PEG-6000、0.5% BSA、0.02% 伊文思蓝）；和包被缓冲液（0.01 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O、0.9% NaCl、0.3%海藻糖和0.1% NaN 3，pH 7.4）。
2.3. 实验仪器
BioJet Quant XYZ3060 分配器购自 Biodot Ltd.（美国加利福尼亚州欧文市）。Medisensor Qcare TRF 系统是一种便携式荧光条读取器，购自 Medisensor, Inc.（韩国大邱）[ 22 ]。读数器的激发波长为333 nm，发射波长为613 nm。该读数器配备数码相机、紫外光源和前面板数字显示屏，用于定量测量。探针超声仪（Scientz-IID）购自宁波Scientz生物科技有限公司（中国浙江省宁波市）。
2.4. 标准品和对照品的制备
通过用稀释缓冲液稀释 PCT 抗原 JG01 (100 ng/mL)，将一系列参考标准设定为 0、0.5、2、10、20 和 40 ng/mL。通过用不含 PCT 的血清稀释 JG01，将三个质量控制设置为 0、2 和 10 ng/mL。
2.5. 与抗体偶联的 CM-EU 的制备
为了制备 CM-EUs-抗体缀合物 (CM-EUs-Ab)，将 2 mg 200 nm CM-EU 在含有 14 µL EDC (10 mg/mL) 和 132 µL sulfo-NHS ( 10 mg/mL)，首先摇动。之后，用1 mL结合缓冲液洗涤活化的CM-EU两次，并在4℃下以15,000× g离心20分钟后弃去上清液。然后通过超声处理将激活的 CM-EU 重悬于 500 μL 结合缓冲液中。添加五十微克抗体（抗PCT MJ03或RIgG）（通过离心过滤装置纯化并浓缩）。偶联反应进行2小时，同时轻轻混合。4°C 10,000× g离心 20 分钟去除未偶联的抗体后，将封闭缓冲液添加到混合物中，摇动 1 小时。随后，通过超声处理将缀合物溶液重新悬浮。最后用25 mmol/L TBS-T缓冲液（pH 7.2）漂洗沉淀3次，4℃保存。
2.6。CM-EU 测试条的制备
CM-EU 测试条由四个部分组成：样品垫、结合垫、NC 膜和吸收垫（图1A）。将样品垫浸入样品垫处理缓冲液中1小时，同时将结合物垫用结合物垫处理缓冲液在室温下预处理1.5小时，然后全部在37℃下干燥3小时。将CM-EUs-RIgG缀合物在标记抗体稀释缓冲液中稀释100倍，并通过XYZ3060分配工作站以1.4μL/mm的速度分配到预处理的缀合物垫上，然后在37℃下干燥4小时。将优化体积的 CM-EU-MJ03 结合物溶液分配到预处理的结合物垫上，然后在 37°C 下干燥 4 小时。通过具有双通道的 XYZ3060 分配工作站，将 16B5 (2.0 mg/mL) 条带喷洒到测试线 (T) 上，并将抗 RIgG (1 mg/mL) 加载到对照线 (C) 上。然后用切条机将板切成3毫米宽的条。将制备好的测试条存放在干燥箱中。
图1
测定程序的示意图。( A )将含有降钙素原(PCT)的样品加到样品垫上；( B ) PCT与CM-EU-MJ03缀合物结合并通过毛细管作用沿着多孔膜迁移；( C ) 形成的复合物继续沿膜迁移，PCT 被 16B5 捕获，在测试线上形成 CM-EU-MJ03-Ag-16B5 复合物。CM-EU-RIgG 持续迁移至对照线，并被抗 RIgG 捕获。多余的荧光微球继续向吸收垫迁移；( D )便携式小型信号采集装置；( E ) 选择“Rom 设置”的预览图像；( F ) 荧光峰高由读数器测量。
2.7. 血清样本
共采集南方医科大学南方医院（中国广州）患者血清样本234份，其中男性140例，女性94例（年龄2~97岁）。所有样品在使用前均储存在-20°C。该研究经南方医科大学临床研究伦理委员会审查批准。
2.8. 样品检测与分析
最初，将 30 μL 样品（标准品或血清）和 30 μL 样品稀释缓冲液充分混合。将混合溶液添加到样品垫上。15分钟后，读数器观察T线（H T）和C线（H C ）荧光强度结果。设置一系列参考标准品（0、0.5、2、10、20和40 ng/mL）用于标准曲线制作和信噪比（SNR）测量。将标准品 0 ng/mL (H T0 )的荧光设为噪声，将其他可能含有 PCT 的样品 (H Ti , i 指除 0 标准点之外的任何其他样品) 的荧光设为信号。计算H Ti /H T0比率以进行有效性评估。高于 2000 的H T0不被接受。
2.9. 统计分析
采用OriginPro 7.5 (OriginLab)和SPSS 13.0 (Chicago, IL, USA)进行线性回归分析、一致性分析和Pearson相关系数。p < 0.05 被认为具有统计显着性。
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3. 结果
3.1. 新检测系统建立及数据判断
新型检测系统的原理如图所示图1。采用基于抗原抗体反应的夹心免疫分析法，对带有Eu (III)标记的层析试纸条进行检测。捕获抗体（16B5 在 T 线上，抗 RIgG 在 C 线上）和标记抗体（CM-EUs-MJ03 或 CM-EUs-RIgG，在结合垫上）预先分配在试纸条上（图1A）。当样品加载到样品垫上时，分析物迁移到结合垫并与 CM-EUs-MJ03 结合（图1B）。复合物（CM-EUs-MJ03-PCT）到达T线后，被抗PCT（16B5）捕获并形成CM-EUs-MJ03-PCT-16B5复合物（图1C）。CM-EUs-RIgG 将仅随样品缓冲液一起迁移。当它们到达 C 线时，被抗 RIgG 捕获并形成 CM-EUs-RIgG-抗 RIgG 复合物（图1C）。反应完成后，试纸条将被放入便携式读取设备中（图1D）。该阅读器尺寸为348×240×221毫米，配备有紫外（UV）光源和用于检测的数码相机，以及用于观察定量测量水平的前显示屏。“Rom 设置”的预览图像将选择吸收波长 333 nm 和发射波长 613 nm（图1E）。T 线 (H T ) 和 C 线 (H C )的荧光峰高由读数器测量并呈现（图1F）。H T用于定量，H C作为内参。
3.2. 反应参数的优化
3.2.1. 捕获抗体（16B5）的最佳量
用包被缓冲液将捕获的抗体 (16B5) 稀释至 2.0 mg/mL。设置两种不同的喷涂速度以优化16B5的最佳用量。A方案中，将抗RIgG（1mg/mL）以0.08μL/mm的速度喷洒到对照线（C）上，将16B5以0.08μL/mm的速度喷洒到测试线（T）上。毫米。B方案中，抗RIgG的处理与A方案相同，但16B5以0.12μL/mm的速度喷洒到T线上。此处使用一系列参考标准品（0、0.5、2、10、20 和 40 ng/mL）来测量信噪比 (SNR)。较低的 H T0（高于 2000 不被接受）、较高的 SNR 和较好的线性斜率被认为具有较好的有效性。结果表明，方案 A 具有更低的 H T0（1138 vs. 2048）、更高的 SNR 和更好的线性斜率（图2A）。选择了A计划。
图2
不同喷雾速度（ A）和浓度（B ）的优化结果。
3.2.2. CM-EU-MJ03 结合物的最佳浓度
当 T 线和 C 线上两种捕获抗体（16B5、Anti-RIgG）的优化喷雾速度固定为 0.08 μL/mm 时，不同浓度（0.01 mg/mL、0.1 mg/mL 和 1 mg/mL）设定为 CM-EU-MJ03 缀合物的最佳选择，速度为 0.08 μL/mm。此处使用一系列参考标准品（0、0.5、2、10、20 和 40 ng/mL）来测量信噪比 (SNR)。较低的H T0、较高的SNR和较好的线性斜率被认为具有较好的有效性。结果表明，当CM-EU-MJ03缀合物浓度为0.1 mg/mL时，具有最高的SNR和最好的线性斜率（图2B) 以及较低的 H T0（0.01 mg/mL 为 1277 vs. 457，1 mg/mL 为 13,628）。因此，CM-EU-MJ03今后的使用浓度选择0.1 mg/mL。
3.3. 绩效评估
基于上述优化实验，我们制备了优化参数的小批量产品。所有测试条在相对湿度低于40%的室温下干燥4小时，切割（3毫米宽），并置于一次性盒中。所有产品均储存在干燥箱中以供进一步评估。
3.3.1. 分析灵敏度和线性度
根据六种系列会议标准品（0、0.5、2、10、20 和 40 ng/mL）的测量获得标准曲线。将标准品 0 ng/mL (H T0 )的荧光设为噪声，将含有 PCT 抗原 (JG01) 的其他标准品 (H Ti , i 指除 0 之外的任意标准点) 的荧光设为信号。计算H Ti /H T0比率。通过将H Ti /H T0 (y)的对数与PCT浓度的对数(x)作图来绘制标准曲线。在这些优化条件下，我们为所提出的检测方法获得了合理的校准曲线（图3A）。回归曲线方程为log(y) = 1.1143 + 0.8529log(x)，皮尔逊相关系数(r = 0.9994)。所提议测定的分析灵敏度为 0.08 ng/mL，定义为零标准的平均值加上两个 SD ( n = 20)。这些结果表明了所开发的 CM-EU 测试条的优异性能。
图3
标准曲线及相关分析结果。( A )PCT标准曲线；( B ) 使用开发的 CM-EU 测试条和 Roche Elecsys BRAHMS PCT 试剂盒测量的 234 份血清样本中 PCT 的比较。
3.3.2. 准确性
通过回收率测试评估测定的准确性。测量时将高浓度 PCT（62.8 ng/mL，由 Roche Elecsys BRAHMS PCT 试剂盒测量）的血清样品稀释成三个稀释度。计算回收率（测量值/期望值）。结果显示，它们在 0.93 到 1.05 之间（表格1）。
表格1
CM-EU 测试条的准确度结果 ( n = 3)。
样本 1:2 1:4 1:8
预期（纳克/毫升） 31.40 15.70 7.85
平均值±SD (ng/mL) 29.96±2.05 16.85±1.05 7.94±0.55
恢复 1.05 0.93 0.99在单独的窗口中打开
3.3.3. 精确
使用设置为低（标准 I：0.5 ng/mL）、中（标准 II：2.0 ng/mL）和高（标准 III：10 ng/mL）的三种参考标准浓度进行重复测试。批间 CV 范围为 5.4% 至 7.7%，批内 CV 范围为 5.7% 至 13.4%（表2）。
表2
CM-EU 测试条的精确度结果。
参考文献（纳克/毫升） 批间精密度 ( n = 5) CV 2 % 测定内精度 ( n = 3 × 2) 简历 ％
平均值（纳克/毫升） 标准差1（纳克/毫升） 平均值（纳克/毫升） 标准差（纳克/毫升）
0.5 0.502 0.032 6.4 0.53 0.036 6.8
2.0 2.08 0.16 7.7 2.17 0.29 13.4
10. 10.16 0.55 5.4 10.35 0.59 5.7在单独的窗口中打开
1 SD：标准差；2 CV：变异系数。
3.3.4. 特异性
测量 CRP (50 ng/mL)、IL-6 (1 IU/mL)、人降钙素 (60 ng/mL) 和人抗钙剂 (30 ng/mL)。所有结果均低于 0.08 ng/mL（表3）。这表明所开发的CM-EUs试纸条与CRP、IL-6、人降钙素、抗人钙没有交叉反应。
表3
CM-EU 测试条的精确度结果。
样品浓度 样本的特异性 测试结果（ng/mL）
50纳克/毫升 反应蛋白 <0.08
1国际单位/毫升 白细胞介素6 <0.08
60纳克/毫升 人降钙素 <0.08
30纳克/毫升 人体抗钙 <0.08在单独的窗口中打开
3.4. 临床样本分析
使用开发的 CM-EUs 试纸和 Roche Elecsys BRAHMS PCT 试剂盒测量了总共 234 名患者的血清样本。相关分析的结果呈现在图3B. 两次测定之间具有高度相关性（y = 0.898x + 0.750，r = 0.977，p < 0.0001）。此外，根据对照试剂盒的测定浓度将样品分为四组（<0.5 ng/mL、0.50~2.00 ng/mL、2.00~10.00 ng/mL、>10.00 ng/mL）时，Kappa值为0.875。 （表4）。因此，与Roche Elecsys BRAHMS PCT试剂盒相比，开发的LFIA结合TRFIA系统用于PCT显示出优异的性能。
表4
两种测定的一致性分析。
基于 CM-EU 的测试 Trip Assay（ng/mL） Roche Elecsys BRAHMS PCT 试剂盒（ng/mL） 全部的
<0.50 0.05≤PCT≤2.00 2.00<PCT≤10.00 >10
<0.50 83 0 0 0 83
0.05≤PCT≤2.00 0 5 8 0 13
2.00<PCT≤10.00 0 6 95 2 103
>10.00 0 0 3 32 35
全部的 0 11 106 34 234在单独的窗口中打开
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4。讨论
近几十年来，PCT已被视为临床上有用的标志物。脓毒症和其他细菌感染患者的血清 PCT 水平将显着高于正常水平。PCT的诱导期（4至12小时）比细胞因子长，但比C反应蛋白（CRP）短[ 23 ]。PCT也是一种相对稳定的蛋白质，半衰期约为22至35小时[ 24 ]。PCT反映了抗生素的有效性，可用于指导抗生素治疗，减少抗生素的滥用，有利于减少治疗浪费，避免细菌耐药性[ 7 , 8 ]。一种快速、方便、廉价、定量的PCT检测方法对于满足临床的广泛应用是非常必要的。
新开发的系统是基于TRFIA结合LFIA的双抗体夹心免疫荧光检测。测试可在15分钟内完成，并通过便携式阅读器设备现场提供定量结果。对234个临床样本的对比研究表明，新开发的系统与Roch Elecsys BRAHMS PCT具有极好的一致性（r = 0.977，Kappa = 0.875），但Roch Elecsys BRAHMS PCT需要25分钟，这是一个更大的时间分析仪器，限制了设备不足的地区的可用性。胶体金试剂盒可以快速、方便地在现场使用，但无法准确定量。
由于层析试纸条特性之间的不均匀性是侧流试纸条定量检测的限制，因此我们采取了多种策略来在我们的工作中实现理想的可重复性和准确性。首先，我们根据制造商提供的规格和我们实验室团队的经验，选择了最适合设计要求的理想硝化纤维（NC）膜[ 25,26,27 ]。不同的膜具有不同的物理和化学属性，影响其毛细管流动特性。毛细管流动特性反过来又影响试剂沉积、测定灵敏度、测定特异性和测试线一致性。当毛细管流速相对较快时，会在较短的时间内完成，并且可能会消耗更多的试剂并降低灵敏度。影响的大小和可接受的限度对于检测、试剂和制造商来说是独特的。为了选择理想的膜，应考虑速度、灵敏度和成本之间的平衡。消耗更少试剂并实现更高灵敏度的检测可能是传染病检测最理想的方法。在我们的研究中，PCT是诊断和鉴别诊断细菌感染与病毒感染的标志物。根据制造商提供的规格和我们实验室团队的经验，选择了HF135，它最符合快速性和灵敏度的设计要求。还进行了验证性实验。结果表明，所选膜（HF135）阳性结果荧光值较高，阴性背景荧光信号较低，均匀性良好（数据未显示）。其次，优化在线样品的浓度和喷雾速度，避免样品堆积。第三，采用自动双通道喷雾装置，实现喷雾精度和均匀性。第四，在垫片过程中对工艺流程和质量控制要求严格，并且膜彼此重叠以保证所制造的所有条带上的流动动力学均匀的一致性。最后，我们计算 H Ti /H T0比率（SNR），以评估抵消样品基体和条带造成的干扰和不均匀性的有效性。重复性结果显示，批间CV不超过7.7%，批内CV范围为5.7%至13.4%。准确度结果显示回收率在0.93~1.05之间。它们的检测性能都是高度可接受的。
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5。结论
开发了一种快速、灵敏、定量的试剂盒，用于现场检测人血清中的 PCT。与现有同类产品相比，研究工作亮点如下：（1）该方法将镧系螯合纳米颗粒（CM-EUs）应用到基于LFIA的方法中作为PCT检测的荧光标记，具有鲜明的特点以保证高灵敏度和准确度。与 LFIA 和 TRFIA 结合，提高了定量 POCT 的检测性能；（2）为了抵消样品基体和条带造成的干扰和不均匀性，计算H Ti /H T0比值（SNR）进行有效性评估；(3)实现了利用会议标准曲线结合H Ti /H T0比值模型进行定量检测。所有结果和优点表明，基于 TRFIA 与 LFIA 相结合的新开发系统可能是定量即时检测中其他生物标志物的有用平台。
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致谢
【基金】：广东省公益性科研与能力建设项目(2014A020212205)
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作者贡献
WWX构思并设计了实验；XYS进行了实验并撰写了论文；CRW提供临床样本并分析数据；CMX、XGW、RLL贡献试剂/材料/分析工具；WWX 和 XYS 还修改了手稿。
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利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
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参考
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